离心铸造_需经过重新悬浮和再离心若干 次

　　离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的 沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。

　　一、离心机的种类与用途 离心机按用途有分析用、制用及分析-制之分；按结构特点则有 管式、吊蓝式、转鼓式和碟式等多种；按转速可分为常速（低速）、高速 和超速三种。

　　1．常速离心机 常速离心机又称为低速离心机。其转速在 8000 rpm 以内，相对 离心力（RCF）在 104g 以下，主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残 渣等固形物，和粗结晶等较大颗粒。常速离心机的分离形式、操作方式和 结构特点多种多样，可根据需要选择使用。

　　2．高速离心机 高速离心机的转速为 1x104~2.5x104 rpm，相对离心力达 1x104~1x105g，主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。 为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速 离心机装设了冷冻装置，称高速冷冻离心机。

　　3．超速离心机 超速离心机的转速达 2.5x104~8x104 rpm，相对离心力达 5x105g 甚至更高一些。超速离心机的精密度相当高。为了防止样品液溅出，一般 附有离心管帽；为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减 少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。此外还有一系列安全保护系统、制 动系统及各种指示仪表等。 分析用超速离心机用于样品纯度检测时，是在一定的转速下离心一段 时间以后，用光学仪器测出各种颗粒在离心管中的分布情况，通过紫外吸 收率或折光率等判断其纯度。若只有一个吸收峰或只显示一个折光率改 变，表明样品中只含一种组分，样品纯度很高。若有杂质存在，则显示含 有两种或多种组分的图谱。 分析用超速离心机可用于测定物质的沉降系数。沉降系数是指在单位 离心力的作用下粒子的沉降速度。以 Svedberg 表示，简称 S, 单位秒， 1S=1x10-13s。 S 可通过超速离心，根据转速、离心时间和粒子移动的距离，按下列 公式求出：

　　式中 ω ：角速度；t2-t1：离心时间（s）；X2,X1：分别为 t2 和 t1 时，运动粒子到离心机转轴中心的距离（cm）。

　　二、离心分离方法的选择 离心分离的方法可分为三类： 1．差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的 方法，称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心 力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再 进行离心，分离较小的颗粒。如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。 差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干 次，才能获得较纯的分离产物。 差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便， 但分离效果较差。离心铸造

　　2．密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的组分 得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度 介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分 离组分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活，常用的有蔗糖、 甘油等。使用多的是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度 5%~60%，密度 1.02~1.30 g/cm3。 密度梯度的制可采用梯度混合器，离心铸造也可将不同浓度的蔗糖溶液，小 心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。离心前， 把样品小心地铺放在预先制好的密度梯度溶液的表面。离心后，不同大 小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干 条界面清晰的不连续区带。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。 在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改 变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大 离心力而缩短离心时间，可减少区带扩宽。

　　3．等密度离心 将 CsCl2、CsSO4 等介质溶液与样品溶液混合，然后在选定的离心力 作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场中沉降形成密度梯度，样品中 不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形成区带。前述密度梯度离 心法中，欲分离的颗粒未达到其等密度位置，故分离效果不如等密度离心 法好。 应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，铯盐会沉淀管底，严 重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓 度和离心机转速及离心时间。此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性， 故使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干燥。

　　三、离心条件的确定 离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心 方法、离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时 间。此外还要注意离心介质溶液的 pH 值和温度等条件。

　　1．离心力 物质颗粒在离心场中所受到的离心力（Fc）的大小，决定于颗粒的质 量(m)和离心加速度(ac): Fc=m ac 离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径：ac =ω 2r 式中 ω ：转子的角速度（rad/s）；r：旋转半径，即颗粒到旋转轴中 心的距离(cm)。 若转速以惯用的每分钟转数（r/min）来表示，则：

　　式中 n: 转子每分钟转数（r/min） 在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示，如 0 rpm；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示， 如 65000g。 相对离心力是指颗粒所受的离心力与地心引力（重力）之比。即 RCF=Fc/Fg=1.12×10-5*n2*r×g 式中 RCF：相对离心力（g）；n：转子每分钟转数（rpm）； r：旋转 半径(cm)；g：重力加速度，980.6 cm/s2 由此可见，离心力的大小与转速的平方及与旋转半径成正比。在转速 一定的条件下，颗粒离轴心越远，其所受的离心力越大。在离心过程中， 随着颗粒在离心管中移动，其所受的离心力也随着变化。在实际工作中，离心铸造 离心力的数据是指其平均值。即是指在离心溶液中点出颗粒所受的离心 力。

　　2．离心时间 离心时间的概念，依据离心方法的不同而有所差异。对于差速离心来 说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。对等密度梯度离心而言， 离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间；而密度梯度离心的时间 则是指形成界限分明的区带的时间。 密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影 响因素很复杂，可通过实验来确定。差速离心所需的沉降时间可通过计算 求得。 颗粒的沉降时间是指颗粒从离心样品液面完全沉降到离心管底所需 的时间，又称澄清时间。沉降时间决定于颗粒沉降速度和沉降距离。 对于已知沉降系数的颗粒，其沉降时间可由下列公式计算：

　　式中 t：沉降时间（s）；S：颗粒的沉降系数（1x10-13S）；ω ：转 子角速度（rad/s）；r1,r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底 的距离（cm）。

　　转子的效率因子 K 与转子的半径和转速有关。对于具有某一沉降系数 S 的颗粒而言，K 值越小，其沉降时间越短，转子的使用效率就越高。

　　式中 T：沉降时间（s）；μ ：介质溶液的黏度（g/（cm.s））；ρ ， ρ 0：分别为颗粒和介质溶液密度（g/cm3）；d：颗粒平均直径（cm）； r1,r2：分别为旋转轴中心到离心管底和液面的距离（cm）。

　　3．温度和 pH 值 为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方 面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的 Ph 值等离心条件。离心 温度一般控制在 4℃左右，对于某些热稳定性较好的酶等，离心也可在室 温下进行。但在超速或高速离心时，转子高速旋转会发热从而引起温度升 高。故必须采用冷冻系统，使温度保持在一定范围内。离心介质溶液的 pH 值应该是处于酶稳定性的 pH 范围内，必要时可采用缓冲液。另外，过酸 或过碱还可能引起转子和离心机的其他部件的腐蚀，应尽量避免.
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