离心铸造_2细胞生长的空间密度是细胞培养

　　有的细胞，养着养着就飘了；有的细胞，养着养着就污了；有的细胞，养着养着就没了 ；有的师妹，看着看着就......

　　自从实验室新来的师妹养了细胞，她整个人都变得神经兮兮，恨不得时刻都要守着它，同它定期谈心解闷，为它做心理诊疗。疫情期间，她为了每天照顾细胞，甚至主动隔离在实验室。

　　对于那些柔弱的细胞，她更是花大心思呵护，死死守住「呵护柔弱细胞的各项准则」，并严格执行。例如，胰酶消化不能过久，吹的时候要轻柔，离心的时候要注意转速和时间。每天都要去看亿下细胞，肉眼观察培养基状况，显微镜下观察细胞生长的状况。

　　一旦发现显微镜下出现类似杂菌和小黑点，整个人就开始狂躁，如果有支原体出现的迹象，她整个人似乎要陷入窒息状态。

　　就这样坚持了很长一段时间，师妹看着细胞茁壮成长，实验眼看就要出结果了，以为发SCI的胜利时刻就在眼前了，第二天醒来，她却发现细胞都挂了，此时她因为实验室封闭不仅回不了宿舍去调整心情，还无法重新购置一批新的细胞重头来过……

　　此刻，师妹有多崩溃，细胞有多矫情，相信大家都感受到了。总之，养细胞就要像养一样，不仅要有温柔和耐心， 还要掌握TA的生长习惯， 注重TA的生长环境，为重要的是你得有足够的技巧去驾驭TA。

　　正所谓“万事开头难”，即便是细胞复苏与保存这两件看似简单的事情，也能造成实验汪内心无比巨大的阴影面积。

　　好在养了6年细胞的我，手里有本细胞培养秘籍，可让细胞这个脆弱的熊彻底变为师妹的实验好帮手，拯救正在被细胞折磨的各位实验室打工人！干货秘籍如下：

　　其实，刚刚复苏的细胞就像是刚刚出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的细心呵护，不然，细胞就会被我们花样养死。为了避免细胞不明不白的挂掉，我们就要对细胞的各种习性了如指掌。

　　1.俗语道，到什么山上唱什么歌，不同细胞用不同的培养液。此时，就不得不提起培养基里的“四大金刚”—MEM、DMEM、1640、F-12，它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。

　　DMEM作为随时紧跟老大MEM的二弟，青出于蓝而胜于蓝，浓度要高出2~4倍，可分为高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。

　　老三1640中规中矩，营养成分比较简单，比DMEM少一点糖和谷光甘肽，常用于淋巴细胞的培养。

　　小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L－细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2，即可形成神经生物学通用的培养基。

　　2.细胞生长的空间密度是细胞培养的关键。具体养细胞时应该摸索细胞喜欢的生长空间密度，即不能让细胞瓶里的细胞因拥挤不堪而萎靡不振；也不能让细胞浓度低于1~5×10 5 个/mL而导致“孤独死”（因为细胞的健康生长需要细胞间的连接）。因而细胞接种前，要先通过细胞计数来调整细胞浓度。

　　3.当培养的贴壁细胞形态不好时，可在传代时，先倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清都可以）洗涤一次，用滴管吸走，再加入3ml培养基，沿着瓶底轻轻吹打一遍，然后吸走。这时再正式进行消化、吹打。

　　其次，把吹打下的细胞悬液加入到含有新培养基的培养瓶内，置于培养箱里培养，按时间点观察细胞贴壁情况（10min,20min,30min）。而后迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次，然后加入完全培养基培养并观察细胞生长情况以及形态。直至找到细胞完美的形态为止。

　　4.至于在培养瓶中加入多少培养基量，则需要实验汪们自己去摸索的。对于生长快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基，细胞形态会更好，但是要注意对换液时间的把握。

　　5.如何选择培养瓶：一般，生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好；生长速度快的细胞，用玻璃瓶培养的效果会更好。因此，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候（比如细胞刚复苏时或者原代培养），塑料瓶会好一点；而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。

　　6.细胞冻存时，盖子要拧紧，不然复苏水浴时会渗水，造成细胞污染。因而冻存管要选择原配的管子和盖子（不同牌子、型号的管子会有差别），盖子拧紧后用封口膜封住。且每支冻存管都要标上细胞的名称、冻存时间，并记录在册，以免后续复苏细胞时，取错细胞。

　　7.细胞冻存时要严格进行梯度降温（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡，谨记：缓降温！但如果真心赶时间时，可使用细胞冻存盒进行细胞冻存，而后尽快将其转入液氮中。此外，要定期测量液氮罐里的液氮储，以保证细胞全部浸在液面下。

　　8.细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。

　　9.提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会对细胞有毒性）

　　10.复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。

　　DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。

　　DMSO在溶解过程中会放热，应先与培养基混匀后再加血清，同时冻存液提前配置，DMSO现配对细胞的毒性可能更大；

　　复苏时，要离心去除DMSO，并用新鲜的培养基洗涤1-2次，注意离心的时候速度不要太快。

　　细胞培养小技巧今天就讲到这里。建议你可以先把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

　　其实很多时候，我们是不清楚到底是哪方面出现问题的，这个时候就需要一步步去排除可能原因，切勿盲目地一次性改变多个条件。

　　细胞培养是一个不断进步的过程，要想成为达人，看几篇文章哪够？在平时做好积累，量变才会有质变，《细胞培养（第3版）》则全方位介绍了细胞培养的方方面面，实为一本不错实验秘籍，收下即可顺利发SCI！

　　本书作为研究生教学用书,简要介绍细胞培养的基础理论，较详细地叙述哺乳类动物细胞培养必需的用品器材、具体的操作步骤及操作提示等。手把手教你培养细胞，很适合小白入门。

　　本书除了细胞培养基本知识，细胞培养室的设置、设和准工作，细胞培养用液及培养基外，本书还补充了一些细胞培养的新技术，如三维细胞培养技术、各类肿瘤试验模型、诱导多能干细胞培养、细胞克隆形成及杂交瘤细胞制等。一本书就可以掌握细胞培养术，高效又全面，可为大家节省不少搜集资料和经验的时间和精力。

　　内含细胞检测相关的仪器分析技术：流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电子电镜、透射电子电镜、原子力显微镜及活细胞工作站。

　　作为一本养细胞的经典书籍，这本书自诞生以来更是好评不断，我随手给大家放两条读者好评，供大家参考。

　　总而言之，它是实验室打工人需要的一本书，虽然网络上细胞培养的相关文章满天飞，但是内容不一定、齐全，所以如果你是准进行细胞培养的人，那我们墙裂建议细胞新手，用这本书系统学习一下。

　　后，祝你的细胞宝宝健康成长，积极献身于伟大的实验事业！大家对细胞培养方面还有什么想要了解的，都可以留言中告诉我哦~我将在线为各位答疑解惑！

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